革蘭氏染色法（細菌形態學檢查實驗）

原理

細菌經結晶紫初染染成藍色。革蘭氏染色陽性菌（G+）細胞壁肽聚糖層數多，且肽聚糖為空間網狀結構，再經乙醇脫水，網狀結構更為致密，染料復合物不易從細胞內漏出，仍為藍色。而革蘭氏染色陰性菌（G-）細胞壁脂類含量多，肽聚糖層數少，且肽聚糖為平面片層結構，易被乙醇溶解，使細胞壁通透性增高，結合的染料復合物容易泄漏，細菌被脫色為無色，再經石炭酸復紅稀釋液復染成紅色。

材料與儀器

金黃色葡萄球菌24h斜面培養物大腸桿菌24h肉湯培養物革蘭氏染色液生理鹽水載物玻片接種環

步驟

一、方法

1. 按涂片→干燥→固定→染色→鏡檢的順序進行。準備載物玻片：用鑷子從載物片缸中取出經3％鹽酸酒精脫脂的載物玻片，用擦片布擦凈，然后用特種鉛筆在玻片背面畫一個直徑為1.5~2.0cm的圓圈，做為涂膜的標記范圍。

2. 點燃煤氣燈：先把煤氣燈的煤氣孔和通氣孔閉上，再把管道的煤氣開關打開，然后把煤氣燈的煤氣口稍稍開放，立即用火柴點燃之，適當調節煤氣孔和通氣孔，使火焰長度在8~10cm，并能分清內外焰為止。

二、步驟

1. 涂片：按無菌操作取材法進行，具體步驟如下：

用肉湯培養物涂片：

（1）右手拿接種環的黑色塑料柄部分，左手托持試管。

（2）將接種環按15°角放在煤氣燈的外焰中燒灼滅菌，直到把金屬絲燒紅(圖1-2)，然后將鋁制的銀色柄部也通過火焰略加燒灼。

（3）用右手小指和手掌的前內緣拔掉左手所持試管的棉塞，并立即將試管口用火焰燒灼滅菌。

（4）用滅菌后已冷卻的接種環伸入試管中取出材料(圖1-3)，此時注意勿使沾有材料的接種環觸碰試管壁及試管口。

（5）將試管口再次滅菌，棉塞也要在火焰上略加燒灼（時間要短以免點燃棉塞），塞好棉塞，放回原處。

（6）將接種環上之材料涂于載物片上，隨后立即將接種環用火焰燒灼滅菌。為防止細菌濺散污染環境，接種環滅菌前，須先將接種環靠近火焰或放內焰中烤干，然后再在外焰中燒紅滅菌，殺死殘留的細菌。

用斜面培養物涂片：

用細菌斜面培養物涂片，需預先取一接種環生理鹽水放在載物片上，然后再按無菌操作取材法從斜面培養物上取少量菌苔，在水滴內輕輕研磨將細菌制成菌懸液，再涂成一薄膜。無菌操作取材步驟同前。

2. 干燥

放空氣中自然干燥。如欲加速，也可把涂片置于火焰上部的熱氣層中烘烤，但切勿將涂膜烤焦。

3. 固定

用染色夾子夾住涂片，在火焰的最熱部分連續通過三次，以固定之。此時殺死大部分細菌，并使標本固定于玻片上，以免在染色或水洗過程中被沖掉。

4. 染色

①將結晶紫染液加于涂膜上，染色（初染）1 min。

②水洗后加蘆戈氏碘液處理(媒染)1 min。

③水洗后用95%酒精脫色，脫色時頻頻搖動玻片，直至流下的液體無色為止(約需0.5 min)。

④水洗后加石炭酸復紅稀釋液染色(復染)0.5 min。

⑤水洗，用濾紙輕輕吸干，待標本充分干燥后進行鏡檢。

染色過程中，水洗要用自來水的細流徐徐沖洗，沖洗涂膜的背面，勿使強水流直接沖到涂膜上。

三、結果觀察

使用油鏡觀察，注意標本中兩種細菌的形態、大小、排列各如何，最后判定染色性，哪種細菌是革蘭氏陽性菌(染成紫色)，哪種細菌是革蘭氏陰性菌(染成紅色)。

將在標本中觀察到的細菌形態和染色性，用有色鉛筆畫出模式圖，并附以文字說明。

注意事項

1. 酒精脫色是革蘭氏染色中的重要環節，如脫色過度，則革蘭氏陽性菌可能被誤染為革蘭氏陰性菌，如脫色不夠，則革蘭氏陰性菌可能被誤染為革蘭氏陽性菌，所以脫色時間要很好掌握。脫色時間的長短還受涂片厚薄的影響，一般涂片時取菌要少，涂片薄而均勻為好。

2. 被檢菌的培養條件、培養基成分、菌齡的不同等原因會影響染色結果，如革蘭氏陽性菌的陳舊培養物也有出現革蘭氏陰性的幾率，所以被檢菌的菌齡一般最好在18~24h之內。

常見問題

一、革蘭氏染色液的制備

1. 結晶紫染液

用天秤量取結晶紫5 g放乳缽內研碎，一面研磨一面徐徐加入95%酒精使之溶解。加入酒精全量為100 ml，制成酒精飽和液 (原液)。取原液20 ml，與1%草酸銨水溶液80 ml混合，用濾紙過濾。供革蘭氏染色初染用。

2. 蘆戈氏碘液

碘 1 g 碘化鉀 2 g 蒸餾水 300 ml

配法是先用數毫升蒸餾水溶解碘化鉀，然后加碘使其全溶解，最后加蒸餾水至300 ml。供革蘭氏染色媒染用。

3. 稀釋石碳酸復紅染液

首先，取堿性復紅10 g和95%酒精100 ml，按上述方法同①制成復紅酒精飽合液。取復紅飽和液10 ml，與5%石碳酸水溶液90 ml混合，用濾紙過濾，再用蒸餾水稀釋10倍。供革蘭氏染色復染用。

二、常見的與醫學有關細菌的革蘭氏染色性

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