NK-92（人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細(xì)胞）基本信息：
NK-92是從一位患有急進(jìn)性非霍奇金淋巴瘤的50歲白人男性外周血單核細(xì)胞衍生來(lái)的一株白細(xì)胞介素-2依賴型NK細(xì)胞株。NK-92MI是轉(zhuǎn)染得到的源自NK-92的IL-2非依賴的NK細(xì)胞株，親本細(xì)胞通過(guò)微粒體基因轉(zhuǎn)化法用逆轉(zhuǎn)錄病毒MFG-hIL-2載體攜帶的人IL-2cDNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化。可能由于載體整合到基因組DNA中，轉(zhuǎn)化是穩(wěn)定的。這株細(xì)胞對(duì)很多惡性細(xì)胞有細(xì)胞毒性；鉻釋放試驗(yàn)顯示它能殺死K562和Daudi細(xì)胞。 NK-92（人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細(xì)胞）有以下特征：CD2,CD7,CD11a,CD28,CD45,CD54表面標(biāo)記陽(yáng)性，
NK-92（人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細(xì)胞）特性：
1）來(lái)源：50 years
2）形態(tài)：淋巴母細(xì)胞
3）含量：>1x106 個(gè)/mL
4）污染：支原體、細(xì)菌、酵母和真菌檢測(cè)為陰性
5）規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝
運(yùn)輸和保存
可選擇干冰運(yùn)輸及發(fā)送復(fù)蘇存活細(xì)胞方式
（1）干冰運(yùn)輸，收到后立即轉(zhuǎn)入液氮凍存或直接復(fù)蘇；
（2）存活細(xì)胞，收到后應(yīng)繼續(xù)生長(zhǎng)，傳代達(dá)到細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，再進(jìn)行凍存。具體操作見(jiàn)細(xì)胞培養(yǎng)步驟。
（3）收到細(xì)胞后請(qǐng)拍照，3天內(nèi)如果發(fā)現(xiàn)污染，請(qǐng)及時(shí)拍照與我們聯(lián)系。
NK-92（人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細(xì)胞））用途：僅供科研使用。
細(xì)胞接收后的處理：
1） 收到細(xì)胞后，請(qǐng)檢查發(fā)貨培養(yǎng)瓶的狀況，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染，請(qǐng)拍照后及時(shí)聯(lián)系我們。
2） 在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)時(shí)，最好在低倍鏡（4或5X物鏡)下進(jìn)行，能準(zhǔn)確判斷細(xì)胞的傳代密度。看細(xì)胞的形態(tài)請(qǐng)?jiān)?/span>10X和20×物鏡下，同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照，（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為細(xì)胞需要售后時(shí)提供收到細(xì)胞時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。
3） 觀察好細(xì)胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h。
4） 貼壁細(xì)胞：在運(yùn)輸過(guò)程中貼壁細(xì)胞會(huì)有脫落的現(xiàn)象，如發(fā)現(xiàn)貼壁細(xì)胞有脫落或者脫落后抱團(tuán)生長(zhǎng)，可將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，然后抽出瓶中的培養(yǎng)基和未貼壁細(xì)胞1000rpm離心5分鐘，棄去上清重懸后接種到加有按照說(shuō)明書(shū)細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基的原培養(yǎng)瓶中（或新的培養(yǎng)瓶中）。
5） 懸浮細(xì)胞：T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，然后抽出瓶中的培養(yǎng)基和細(xì)胞1000rpm離心5分鐘，棄去上清重懸后接種到新的培養(yǎng)瓶中（加入按照說(shuō)明書(shū)細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基）。
6）備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)換用按照說(shuō)明書(shū)細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。 收到細(xì)胞后第一次傳代建議1：2傳代 。
NK-92（人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細(xì)胞）培養(yǎng)步驟
一．NK-92（人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細(xì)胞）培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）MEMα+0.2mM Inositol+0.1mM β-mercaptoethanol+0.02mM Folic Acid+100-200U/ml recombinant IL-2+12.5% HS+12.5% FBS+1% P/S
2）培養(yǎng)條件：Atmosphere: Air, 95%; CO2, 5%，Temperature: 37℃。
3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
4）Medium Renewal：every 2 to 3 days
5）Antigen Expression：CD2＋, CD7＋, CD11a＋, CD28＋, CD45＋, CD54＋, CD56＋, CD1 -,
6）Applications：transfection and can be used effectively for immunological ex vivo purging
一． NK-92（人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細(xì)胞）培養(yǎng)注意事項(xiàng)：
1. NK-92和NK-92MI細(xì)胞均為懸浮生長(zhǎng)，大部分細(xì)胞聚集成團(tuán)，少數(shù)分散的細(xì)胞，并且細(xì)胞間隙會(huì)有較多的死細(xì)胞和細(xì)胞碎片；
2. NK-92和NK-92MI細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)需求很高，建議使用進(jìn)口胎牛血清和馬血清培養(yǎng)，白介2的質(zhì)量對(duì)NK-92的生長(zhǎng)影響很大，正常培養(yǎng)時(shí)換液周期為2天，建議使用半量換液和離心換液交替進(jìn)行，即半量換液1-2次后離心全量換液一次，盡量減少離心次數(shù)；
3. 細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)聚集的細(xì)胞團(tuán)會(huì)逐漸增大，正常的細(xì)胞團(tuán)顯微鏡下為白色透亮的，若細(xì)胞聚集太多，出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)中部發(fā)暗時(shí)可在換液后將細(xì)胞團(tuán)輕輕搖散，或者用移液器輕輕吹散，吹打力度不可過(guò)大，否則會(huì)出現(xiàn)大量死細(xì)胞和細(xì)胞碎片。這個(gè)細(xì)胞沒(méi)有聚團(tuán)的活性很低。細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求也很高，千萬(wàn)不能團(tuán)塊太大營(yíng)養(yǎng)不足，不然48小時(shí)細(xì)胞就會(huì)死亡。這個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)是不準(zhǔn)確的 因?yàn)榧?xì)胞成團(tuán)長(zhǎng)，團(tuán)塊不可能吹散計(jì)數(shù)，還有就是散落的細(xì)胞細(xì)胞活性不好，所以細(xì)胞檢測(cè)活性也是不準(zhǔn)確的。
4. 運(yùn)輸條件可能會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定的影響，收到細(xì)胞后請(qǐng)按以下方法處理：
a) 收到細(xì)胞后靜置，顯微鏡下觀察細(xì)胞并拍照，主要找聚集的細(xì)胞團(tuán)；
b) 將培養(yǎng)瓶豎置，靜置4~6h，肉眼觀察大部分細(xì)胞團(tuán)都沉到底部后，將多余的培養(yǎng)基輕輕倒入50ml離心管中離心收集一部分細(xì)胞，底部留3~4ml（剩余20ml左右時(shí)可換用移液器吸取上清，保證大部分細(xì)胞團(tuán)留在瓶中），補(bǔ)加3~4ml新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，若細(xì)胞量較多可分兩瓶，離心收集的細(xì)胞也可單獨(dú)接種培養(yǎng)；
c) 細(xì)胞對(duì)機(jī)械損傷特別敏感，所以最好是不要離心
5. 細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)不能離心處理，提前準(zhǔn)備一個(gè)離心管，加10ml培養(yǎng)基，把溶解后的凍存細(xì)胞接入，靜置2小時(shí)左右，細(xì)胞都沉降在底部，去上清，用完全培養(yǎng)基接到T25培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)進(jìn)行培養(yǎng)
二．細(xì)胞處理：
1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入250px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3. 按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4. 將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為例；
1．細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入2ml完全培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2．1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。明舟生物（mingzhoubio）按每個(gè)凍存管細(xì)胞數(shù)目大于1X106個(gè)細(xì)胞凍存。
3．將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
培養(yǎng)細(xì)胞請(qǐng)注意
(1)傳代時(shí)細(xì)胞的接種密度應(yīng)控制在 1萬(wàn)-4萬(wàn) 活細(xì)胞/平方厘米。
(2)選用高質(zhì)量的胎牛血清配制培養(yǎng)液。
